Работа 4. Подсчет количества лейкоцитов в камере Горяева
Оборудование: микроскоп, камера Горяева, пипетка, капилляр от гемометра Сали, пробирка с резиновой крышкой.
Реагенты: жидкость Тюрка (100 мл 5%-го р-ра уксусной к-ты и 1 мл 1%-го р-ра генциан фиолетового или метиленового синего), спирт, иммерсионное масло.
Камера Горяева – толстое предметное стекло с четырьмя желобами в средней части, между которыми находятся три узкие площадки, средняя из которых ниже боковых на 0,1 мм и разделена пополам поперечным желобком. По обе стороны от этого желобка расположены сетки, нанесенные на стекло. Сетка Горяева состоит из 225 больших квадратов, из которых 25 расчерчены вертикальными и горизонтальными линиями на 16 малых квадратов. Подсчет лейкоцитов ведут в счетной камере Горяева под малым увеличением микроскопа в 100 неразграфленных больших квадратах. Большой квадрат равен 16 малым, что соответствует 100 х 16 = 1600 малым квадратам. Единицей отсчета является маленький квадрат. Его сторона равна 1/20 мм, площадь 1/20*1/20=1/400 мм 2 . Объем крови, помещающейся над маленьким квадратом, равен 1/400 мм 2 *1/10 мм=1/4000 мм 3 (1/10 мм – высота слоя крови). из 225 больших квадратов
Ход работы. Покровное стекло притереть к камере Горяева до появления радужных колец.
Установить увеличение микроскопа в 280 раз (окуляр на 7, объектив на 40). Поставить камеру на предметный столик микроскопа, найти сетки, рассмотреть.
Пипеткой взять 0,4 мл жидкости Тюрка (5%-ый раствор уксусной кислоты, подкрашенный метиленовым синим) и влить в пробирку.
Набрать кровь в капилляр от гемометра Сали до отметки (0,02 мл); кончик капилляра вытереть ватой; опустить капилляр в пробирку с жидкостью Тюрка; выдуть кровь в пробирку; промыть капилляр, дважды выдувая этот раствор разбавителя. Пробирку закрыть резиновой пробкой, перемешать содержимое. Набрать содержимое пробирки в капилляр. Каплю из капилляра выпустить на среднюю пластинку под притертое покровное стекло к камере Горяева (пузырьки воздуха не должны попасть под покровное стекло). Оставить на 1 мин., чтобы осели клетки крови.
Подсчитать количество лейкоцитов в 100 больших квадратах (или 1600 малых квадратах). Учитывают клетки, находящиеся внутри каждого малого квадрата, на левых и верхних сторонах каждого квадратика. Не считают на нижних и правых сторонах квадрата, т.к. их число учитывается при подсчете лейкоцитов следующего квадрата.
Рассчитать содержание лейкоцитов в 1 м 3 крови. Для этого использовать формулу:
А – количество лейкоцитов в 100 больших квадратах,
4000 – коэффициент для приведения объема к 1 мм 3 (1/4000 мм 3 – объем одного маленького квадрата),
20 – коэффициент разведения крови объемом 0,02 мл,
1600 – количество маленьких квадратов.
Практически для получения действительного содержания лейкоцитов в 1 мкл крови достаточно полученное при подсчете число разделить пополам и приписать 2 нуля (или подсчитанное число клеток крови разделить на 50), ошибка метода составляет ± 7%.
Например, подсчитано 160 лейкоцитов, тогда в абсолютных единицах получаем 8 000 клеток в 1 мкл крови. Для пересчета количества клеток в 1 л (система единиц СИ) необходимо результат умножить на 10 6 , т.е. 8 000*10 6 = 9*10 9 /л.
Оформление работы. Записать или зарисовать последовательность счета клеток в камере Горяева. Подсчитать количество клеток, записать.
Работа 5. Приготовление мазков крови, окрашивание по Романовскому-Гимзе
Оборудование:обезжиренные предметные и шлифовальные стекла, вата, пинцет, пипетка на 10 мл, глазные пипетки, ванночки размером с предметное стекло, карандаш.
Реагенты: кровь рыбы, 70 % этиловый спирт,
В основе методики лежит способность смеси основных (азур II) и кислых красителей (водорастворимый желтый эозин) окрашивать элементы клеток крови в разные цвета и оттенки. Окрашиватся ацидофильные образования в различные оттенки красного цвета, базофильные — в цвета от пурпурного до синего.
Ход работы. Обезжирить предметные стекла
Предметное стекло взять в левую руку между большим и указательным пальцами за короткие грани.
Каплю крови (величиной с зерном пшена) нанести на правый конец стекла (предметным стеклом, углом шлифовального стекла, пипеткой). Капля должна быть такого размера, чтобы конец мазка, приготовленного из нее, не доходил на 1 см до края стекла.
Шлифовальное стекло ставят под углом 45º к основному стеклу у правого края предметного стекла, надвигают на каплю крови так, чтобы у нижнего ребра шлифовального стекла равномерно распределилась капля крови. Распределяют справа налево каплю крови по предметному стеклу равномерно, быстро. Мазок должен быть тонким, ровным, желтоватым, просвечивающимся и отливать должен цветами радуги при просмотре на свет.
 |
А – неравномерный мазок на плохо обезжиренном стекле; Б – короткий мазок; В – длинный и неравномерный мазок; Г – толстый в начале мазок; Д – правильный мазок.
Рисунок 2. Качество приготовленного мазка.
Высушить мазок быстро (под лампой, в термостате, высоко над спиртовкой).
Промаркировать простым карандашом.
Фиксировать в закрытой кювете в этиловом спирте 5 мин., высушить на воздухе.
На дно ч.Петри налить готовую краску Романовского, препарат уложить мазком вниз в краску, закрыть крышкой от ч.Петри (закрытая чашка Петри с увлажнённым фильтром на дне). Мазки окрашивать 20 — 25 минут во влажной камере в термостате при 37 °C.
После окрашивания мазки промыть в проточной воде, сушить на воздухе и исследовать при масляной иммерсии.
Оформление работы. Записать последовательность методики окрашивания.
Последнее изменение этой страницы: 2016-06-23; Нарушение авторского права страницы
2. Подсчёт лейкоцитов в камере Горяева.
Камера Горяева должна быть сухой и чистой. К ней притирают покровное стекло до появления радужных полос. В смеситель (меланжер) для лейкоцитов (белая палочка в шарообразном расширении) до нижней метки “0,5” набирают кровь, а затем до метки “11” за шарообразным расширением 5% раствор уксусной кислоты, которая разрушает оболочки лейкоцитов (в камере подсчитывают их ядра), а кровь в меланжере разводится в 20 раз. Лейкоциты считают в 100 больших квадратах согласно правилу Егорова. Подсчёт производят по формуле:
Л=В*250*20*10^ 6 /100
где Л – количество лейкоцитов в 1 л крови; В – сумма лейкоцитов в 100 больших квадратов; 250 – множитель, приводящий к объёму крови 1 мкл (объём большого квадрата 1/250 мкл); 20 – разведение крови (кровь в меланжере разводится в 20 раз); 100 – число больших квадратов; 10^ 6 – количество мкл в одном литре.
В норме количество лейкоцитов 4-5 10 9 /л. Факторы, влияющие на количество лейкоцитов: возраст; время суток (нормальные биоритмы); приём пищи.
3. Определение содержания гемоглобина методом Сали.
Содержание гемоглобина крови в норме у взрослых: у мужчин 130-160 г/л; у женщин 120-140 г/л. Суточные вариации содержания гемоглобина в периферической крови достигают 15% с максимумом по утрам. У жителей северных регионов и высокогорных районов уровень гемоглобина нередко оказывается выше приведенных значений на 10 г/л. У пожилых людей (старше 65 лет) нижняя граница нормы показателя достигает 122 г/л у мужчин и 110 г/л у женщин.Гемометр Сали представляет собой штатив и состоит из 3 пробирок одинакового диаметра. Одна (средняя) пробирка – пустая, две другие запаяны и содержат стандартный раствор солянокислого гематина определенной окраски. Интенсивность окраски стандарта соответствует идеальной норме – содержанию гемоглобина 166,7 г/л (16,67 г%).
ЦЕЛЬ: освоить определение содержания гемоглобина по методу Сали.
ОСНАЩЕНИЕ: гемометр Сали; 0,1Н раствор хлористоводородной кислоты; дистиллированная вода, капилляр (0,02 мл) стеклянная палочка.
ХОД РАБОТЫ: В свободную градуированную пробирку до нижней кольцевой метки налейте 0,1 Н раствор хлористоводородной кислоты. Специальным капилляром наберите 0,02 мл крови и осторожно выпускайте в пробирку под слой кислоты так, чтобы верхний слой остался неокрашенным. Содержимое пробирки перемешайте и оставьте на 5-10 минут: это время для образования солянокислого гематина коричневого цвета. Затем полученный раствор хлорида гематина темно-коричневого цвета разведите водой до цвета стандарта: по каплям добавляйте дистилированную воду, каждый раз перемешивая стеклянной палочкой. Как только цвет исследуемой жидкости полностью сравняется с цветом стандартов в гемометре Сали, отметьте, какому делению шкалы градуированной контрольной пробирки соответствует нижний мениск жидкости: это и будет искомое количество гемоглобина. Пробирка градуирована в г%, поэтому для перевода значения в г/л полученную цифру нужно умножить на 10.
1 – запаянные пробирки со стандартной жидкостью;
2 – градуированная пробирка;
3 – капилляр с меткой 0,02 мл.
Определите концентрацию гемоглобина в образце крови, предлагаемой для исследования;
сделайте заключение о соответствии полученных вами данных нормативам.
Подсчет лейкоцитов и эритроцитов в камере Горяева
Что такое камера Горяева, ее технические характеристики
Камера Горяева представляет из себя простое устройство для визуального подсчета форменных элементов крови под микроскопическим увеличением. Оно сконструировано на основе предметного стекла, имеющего специальные углубления для номинального объема крови, а также покровного стекла с нанесенной сеткой.
Различают несколько конструкций камеры Горяева в зависимости от количества камер (углублений для заполнения кровью), чаще всего в лабораториях применяются двухкамерные или четырехкамерные модели. Над каждой из камер находится специальная счетная сетка, нанесенная на покровное стекло методом лазерной гравировки либо при помощи микронапыления краски.
Приспособление сконструировано таким образом, что все имеющиеся камеры имеют равный объем, который указан в технической документации модели, их глубина и размеры секторов покровной сетки также стандартны. Это делает возможным переводить после подсчета форменных элементов их суммарные значения в единицы концентрации заданных клеток в объеме крови.
Описание сетки камеры Горяева
Покровное стекло имеет гравировку в виде сетки, большие квадраты которой имеют величину стороны в 1 мм. Чаще всего таких квадратов 9 над каждой счетной камерой, они расположены так, что образуют три столбца по три квадрата в каждом. Те большие квадраты, что располагаются по периферии, разделены на 16 квадратов поменьше, длина и ширина которых равны 0,2 мм. Стандартная глубина камеры под этими квадратами позволяет легко подсчитывать количество клеток в единицах объема, он равен для них 0,1 мм 3 или 10 -4 мл.
Большой квадрат, расположенный посередине, имеет дополнительные разделяющие линии, они нанесены так, что делят каждый из 16 средних квадратов еще на 16 самых маленьких. Их сторона равна 0,05 мм.
Правило Егорова для подсчета форменных элементов
Подсчет форменных элементов крови ведется под микроскопом с применением соответствующего увеличения, чаще всего используется окуляр х10. Подсчитывают число клеток в тех больших квадратах, что разделены на 16 средних, начинают считать от верхнего левого и двигаются вниз направо, захватывая при подсчете 5 больших квадратов.
Для того, чтобы верно определить количество клеток в заданном объеме крови, необходимо исключить повторный подсчет тех форменных элементов, что располагаются на границах или узлах сетки. Такая ошибка привела бы к увеличению подсчитываемого показателя, для ее устранения было сформулировано правило Егорова. Оно гласит, что к данному квадрату относятся те элементы, что лежат в его пределах, не касаясь нанесенных линий, а также те клетки, что располагаются на верхней и левой сторонах квадрата. Те клетки, что «касаются» нижней или правой стороны, при подсчете учитываться не должны.
Методика подсчета лейкоцитов
Для подсчета лейкоцитов в крови в современных клинических лабораториях чаще всего используются специальные автоматические анализаторы, методика подсчета при помощи камеры Горяева относится к редко применяемым из-за своей трудоемкости и низкой скорости анализа. Для того, чтобы верно определить концентрацию отдельных видов лейкоцитов, требуется врач лабораторной диагностики или фельдшер-лаборант, владеющий навыками работы с микроскопом.
Для подсчета отдельных видов лейкоцитов кровь разводят в несколько раз слабым раствором уксусной кислоты, при этом образцы без лейкоцитоза, как правило, следует разводить не менее чем в 20 раз, в случаях выраженного увеличения количества белых кровяных телец может потребоваться большее разведение. Для контрастирования изображения применяют окрашивание метиленовой синью.
После заполнения камер исследуемым объемом крови сверху накладывается покровное стекло сеткой и производится ее притирка, в ходе которой должны полностью исчезнуть пузыри воздуха между двумя стеклами. Заполненная камера помещается под микроскоп, причем целесообразно оставить ее неподвижной на 1-2 минуты для того, чтобы форменные элементы полностью прекратили движение и осели.
После этого на среднем увеличении (окуляр не менее чем х10) проводится подсчет отдельных видов лейкоцитов в не менее чем 100 квадратах. Для перевода получившегося числа в объемные значения необходимо умножить его на разведение (как правило, в 20 раз) и на количество квадратов, участвовавших в подсчете (чаще всего 100). Полученное число дает представление о количестве лейкоцитов в 1 мкл крови.
Методика подсчета эритроцитов
Исследуемую кровь разводят при помощи физиологического раствора минимум в 100 раз для того, чтобы стал возможен визуальный подсчет красных кровяных телец. При недостаточном разведении в камерах образуется двойной слой форменных элементов крови, что делает невозможным их определение. После наложения покровного стекла и притирки проводят микроскопирование препарата при увеличении окуляром х10. Подсчет ведется во всех 5 больших квадратах, разделенных линиями на 16 секторов. Расчет объемных значений проводят при помощи умножения полученного числа эритроцитов на степень разведения (чаще в 100 или 200 раз) и на 4000, затем проводят деление полученного числа на 80 (количество малых квадратов при подсчете). Полученное число характеризует количество эритроцитов в 1 мкл крови.
Методика подсчета лейкоцитов в камере Горяева, нормы показателей и отклонения
Камера Горяева – это приспособление для измерения числа клеток и частиц в определённом объёме жидкости (кровь, моча), состоящее из специального толстого предметного и покровного стёкла.
Предметное стекло имеет углубленную площадку посередине, на которую нанесена сетка из 225 больших квадратов. Из этих квадратов 25 равномерно разделены на 16 меньших квадратов. Благодаря такому объёму сетки подсчёт выполняется точнее, нежели в других ручных счётных устройствах.
Камера Горяева
Обслуживание камеры
После использования инструмента предметное стекло дезинфицируют путём погружения в 4% раствор формалина на час или в 70% раствор этилового спирта на полчаса. После этого камеру тщательно промывают дистиллированной водой. Излишек жидкости убирают мягкой салфеткой. Стоит обратить внимание на то, что камеру нельзя протирать ватным тампоном из-за цепляющихся к ней волокон. Хранится стекло в сухом месте.
Во время использования камеры в подсчитываются те ФЭ, которые располагаются внутри квадрата сетки и на верхней и левой линии его периметра. При этом частицы, касающиеся правой и нижней линии периметра во время расчёта данной клетки не включаются.
Определение лейкоцитов в крови
Методика подсчёта лейкоцитов
Подсчёт количества лейкоцитов начинается с разведения крови в 3-5% растворе этановой кислоты с метиловой синью в 20 раз. Рабочий материал перед применением протирают марлей насухо.
Покровное стекло нужно протереть до возникновения цветных колец Ньютона. Далее, камеру заполняют разведённой кровью, при этом первые две капли выпускают на фильтровальную бумагу. Жидкость попадает в камеру благодаря капиллярному свойству воды. Важно проследить, чтобы в желобки при заполнении ничего не затекало. Если это произошло, жидкость аккуратно убирают фильтровальной бумагой. Затем оставляют сетку в покое на минуту, ожидая, пока ФЭ остановят своё движение.
Подсчёт лейкоцитов осуществляется в пределах ста больших квадратов при малом увеличении, то есть при окуляре 10х и объективе 8х, по правилу Егорова. Полученная цифра используется в формуле.
Х = (n × 250 × 20) / 100 или Х = n × 50
Х – количество лейкоцитов.
n – число, полученное в результате подсчёта в камере.
Количество лейкоцитов определяют, принимая во внимание число больших квадратов сетки – 100 и разведение крови – 20.
Как происходит подсчет лейкоцитов
Норма лейкоцитов и отклонения
Норма лейкоцитов у людей составляет 4,0 – 9,0 × 10⁹/л. Или, по-другому, в 1 кубическом мм крови располагается примерно 6000 белых кровяных клеток.
На отклонения от нормы могут влиять внешние физиологические факторы:
- приём пищи перед сдачей крови;
- стресс;
- беременность или менструация у женщин;
- переохлаждение или перегрев;
- большая физическая нагрузка перед сдачей анализов.
Если количество белых кровяных клеток превышает 9,0 × 10⁹/л (повышены лейкоциты), такое состояние называется лейкоцитозом. Подобную картину можно увидеть при злокачественных заболеваниях крови, инфекциях, поражениях радиацией и отравлениях.
Лекарственные препараты тоже способны увеличить количество лейкоцитов. Некроз тканей, обильные кровотечения, в том числе в результате операций, почечная кома, болезни сердца – всё это может привести лейкоцитозу.
Падение количества лейкоцитов ниже 3,9 × 10⁹/л называется лейкопенией. Однако у некоторых людей фиксируется постоянное число лейкоцитов в количестве 3,5 × 10⁹/л. Принято считать, что у таких людей сохраняется резерв этих клеток в тканях в 50 раз больше, нежели в крови. Еще встречается функциональная лейкопения после введения анальгетиков, сульфаниламидов и других лекарственных препаратов, после долгой мышечной работы, в результате поражения инфекциями и вирусами (тиф, грипп, корь).
Лейкоцитарная формула
Все виды лейкоцитов составляют лейкоцитарную формулу. По ней можно выявить определённые патологии. Нормы формулы меняются в зависимости от возраста и периода жизни человека. Сдвиг хорошо заметен у женщин во время беременности или после родов.
Применяются разные способы подсчёта соотношения видов этих клеток, но все они связаны с тем, что более тяжелые клетки (базофилы, например) располагаются ближе к краю мазка, а лимфоциты, как легкие клетки, остаются в середине.
- Метод Филипченко. В данном способе подсчёт осуществляется по поперечной прямой границы одного конца к другому. Мазок при этом мысленно разделяют на три части.
- Метод Шиллинга. Лейкоциты подсчитывают в четырех участках мазка.
Полученные данные записываются в таблицу. Индивидуально количество каждого вида белых клеток крови высчитывается по формулам. Отмечаются те элементы, которые попали в поле зрения. Счёт ведётся до того, момента, пока сумма всех подсчитанных клеток не составит 100.
Методика подсчёта лейкоцитов в моче
В моче подсчитывается количество лейкоцитов в камере Горяева по Нечипоренко. Этот анализ нужен для мониторинга заболеваний почек. Периодическое исследование мочи помогает проследить за правильностью лечения и эффективностью назначенной терапии.
Сбор мочи
В изучение идёт только первая утренняя моча в середине мочеиспускания. Для пациента важно следовать основным правилам сбора этого биоматериала. Специальной дополнительной подготовки для исследования не требуется.
Методика расчета
10 мл свежесобранной мочи центрифугируют в течение трёх минут при 2,5 тыс. оборотов в минуту. Перед этим необходимо проследить, чтобы моча, во избежание частичного распада клеток, имела слабокислую реакцию.
При помощи пипетки с узким оттянутым концом убирают верхний слой. В пробирке оставляют от 0,5 мл мочи до 1 мл в зависимости от объёма осадка.
Осадок аккуратно перемешивают с надосадочной жидкостью. Полученным раствором заполняют счётную камеру Горяева по схожему принципу, что используется при подсчёте ФЭ крови. Камеру оставляют в покое от 3 до 5 минут.
Лейкоциты необходимо подсчитать в больших квадратах по всей сетке с окуляром 7х и объективом 40х.
Полученная цифра используется в формуле:
Х = (а/0,9) × (1000/V)
Х – число лейкоцитов в 1 мл мочи.
а – подсчитанное количество, делённое на объём камеры в 1 мкл осадка мочи.
v – Количество мочи, взятой для исследования.
1000 – количество осадка.
Это важно! Норма лейкоцитов: в 1 мл мочи не более 2 × 10³ белых кровяных клеток.
Подсчет лейкоцитов в камере Горяева — устройство камеры и принцип подсчета показателей
Работа с камерой Горяева
Камера Горяева – оптическое устройство для подсчета клеток или иных соизмеримых с ними частиц в заданном объеме жидкости. Состоит из толстого предметного стекла, имеющего прямоугольное углубление (камеру) с нанесенной микроскопической сеткой и тонкого покровного стекла. Камера разработана профессором Казанского университета Горяевым Н.К. Благодаря увеличенному объему сетки отличается большей точностью подсчета, по сравнению с другими камерами (Тома, Цейса, Тюрка, Бюркера).
Технические характеристики камеры Горяева
Размеры малого квадрата камеры Горяева 0,05×0,05 мм
Размеры большого квадрата камеры Горяева 0,2×0,2 мм
Глубина камеры 0,1 мм
Объем жидкости под 1 малым квадратом 0,00025 мм3 (мкл) = 1/4000 мм3 (мкл)
Объем жидкости под 1 большим квадратом 0,004 мм3 (мкл) = 1/250 мм3 (мкл)
Объем камеры Горяева 0,9 мм3 (мкл)
Описание сетки камеры Горяева
Сетка камеры Горяева состоит из 225 больших квадратов, из которых 25 разделены на 16 малых квадратов.
Рис 1. Сетка камеры Горяева
Рис 2. Большой (1) и малый (2) квадраты сетки камеры Горяева
Рис 3. 225 больших квадратов сетки камеры Горяева
Рис 4. 100 больших квадратов сетки камеры Горяева
Рис 5. Большой квадрат камеры Горяева разделенный на 16 малых квадратов.
Обслуживание камеры Горяева
Между работой камера должна храниться в сухом месте. После работы камера дезинфицируется погружением на 30 минут в 70% раствор этилового спирта, или на 60 минут в 4% раствор формалина, после чего камера промывается дистиллированной водой и протирается мягкой салфеткой.
Правило подсчета клеток в квадрате (правило Егорова)
В квадрате считаются клетки, лежащие внутри его, а также касающиеся левой и верхней границ. Клетки, касающиеся правой и нижней границ при подсчете не учитываются.
Методика подсчета лейкоцитов в камере Горяева
Развести образец исследуемой крови в 20 раз 3–5% раствором уксусной кислоты с метиленовым синим (например, 20 мкл крови и 380 мкл р-ра уксусной к-ты). Камеру и покровное стекло насухо протереть марлей. Недопускается использование для протирки ватных тампонов из-за остающихся на стекле волокон. Аккуратно притереть покровное стекло к камере, слегка надавливая на него до появления цветных колец Ньютона. Заполнить камеру разведенной кровью и выдержать 1 минуту для прекращения движения клеток. При малом увеличении (окуляр ×10, объектив ×8) посчитать лейкоциты в 100 больших квадратах. Расчет числа лейкоцитов осуществляют, исходя из разведения крови (20) и числа больших квадратов (100), по формуле: X = (a×250×20) / 100, где Х – число лейкоцитов в 1 мкл крови; а – число лейкоцитов, посчитанных в 100 больших квадратах камеры Горяева. Практически, после сокращений в формуле, количество посчитанных лейкоцитов умножают на 50.
Методика подсчета эритроцитов в камере Горяева
Развести образец исследуемой крови в 200 раз в 0,9% растворе NaCl или растворе Гайема (берется 20 мкл крови и 4 мл раствора). Камеру и покровное стекло насухо протереть марлей. Недопускается использование для протирки ватных тампонов из-за остающихся на стекле волокон. Аккуратно притереть покровное стекло к камере, слегка надавливая на него до появления цветных колец Ньютона. Заполнить камеру разведенной кровью и выдержать 1 минуту для прекращения движения клеток. При малом увеличении (окуляр ×10, объектив ×8) посчитать эритроциты в 5 больших квадратах разделенных на 16 малых (т.е. в 80 малых квадратах). Рекомендуется считать клетки в квадратах, расположенных по диагонали. Расчет числа эритроцитов осуществляют, исходя из разведения крови (200) и числа малых квадратов (80), по формуле: X = (a×4000×200) / 80, где Х – число эритроцитов в 1 мкл крови; а – число эритроцитов, посчитанных в 80 малых квадратах камеры Горяева. Практически, после сокращений в формуле, количество посчитанных эритроцитов умножают на 10 000.
Методика подсчета лейкоцитов в камере Горяева
Лейкоциты — белые кровяные тельца — играют главную роль в противомикробной защите организма. Гранулоциты фагоцитируют микробы и разрушают их с помощью ферментов, заключенных в гранулах, лимфоциты вырабатывают антитела и обеспечивают иммунные реакции организма.
Методика определения пробирочным методом: в пробирку наливают 0,4 мл раствора Тюрка (жидкость Тюрка содержит уксусную кислоту для разрушения эритроцитов и метиленовую синь для окраски ядер лейкоцитов). Капиллярной пипеткой набирают из свежей капли 0,02 мл крови, осторожно выдувают ее в пробирку с реактивом и ополаскивают пипетку. Смесь хорошо перемешивают. При этом разведение крови в 20 раз. Концом круглой стеклянной палочки отбирают каплю разведенной крови и наносят на край шлифованного стекла камеры.
Подсчет ведут в 100 больших неразгрефленных квадратах, собранных вместе по четыре. Используется малое увеличение.
Вывод формулы подсчета № 1 .
1. 100 квадратов содержат по площади 1600 малых квадратов (16х 100)
2. Объем крови над малым квадратом 1/4000 мм3
3. Разведение крови в 20 раз
Количество лейкоцитов в 1 мкл крови = в -4000-20. = Ах 50
Например: в 100 больших квадратах сетки Горяева сосчитано 130 лейкоцитов. В 1 мкл крови количество лейкоцитов будет равно 130 х 50=6500, или 6,5-10 3 .
Для того чтобы определить содержание лейкоцитов в 1 л крови, нужно число лейкоцитов, выраженное в тысячах, умножить на 10 9 .
В нашем примере количество лейкоцитов в 1 л крови равно 6,5-10 9 .
Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:
Лучшие изречения: Учись учиться, не учась! 10547 – 
| 7960 – 
или читать все.
188.163.64.82 © studopedia.ru Не является автором материалов, которые размещены. Но предоставляет возможность бесплатного использования. Есть нарушение авторского права? Напишите нам | Обратная связь.
Отключите adBlock!
и обновите страницу (F5)
очень нужно
Камера Горяева. Практическое применение
- Просмотров: 48103
Лабораторная камера Горяева, названная в честь русского врача, профессора Казанского университета Горяева Н.К., является специальным монолитным предметным стеклом, предназначенным для подсчета количества клеток в заданном объеме жидкости. Кроме того, используя камеру Горяева можно определить увеличение микроскопа. Камеры Горяева широко применяются в области клинических и биомедицинских исследований.
Популярные области применение камеры Горяева:
- Подсчет форменных элементов крови
- Подсчет эритроцитов
- Подсчет лейкоцитов
- Подсчет ретикулоцитов
- И т.п.
- Подсчет форменных элементов мочи
- Исследование эякулята – оценка количественных и качественных параметров сперматозодиов
- Вычисление концентрации спор в вакцине
- Подсчет ооцист в препарате
- И т.п.
Камеры Горяева выпускаются в двух модификациях: двухсеточные (двухкамерные) и четырехсеточные (четырехкамерные). В определении цены камеры Горяева важную роль играет качество шлифовки стекла, метод нанесения сетки – лазерная гравировка или же вакуумное напыление.
Что собой представляет камера Горяева? Камера Горяева есть не что иное, как прозрачное монолитное предметное стекло поперечными прорезями и нанесенной специальным образом микроскопической сеткой. В случае двухкамерной камеры Горяева мы имеем четыре прорези, образующие три поперечно расположенных площадки, при этом средняя площадка разделена продольной прорезью на две одинаковых камеры, на каждой из поверхности площадки которых нанесена сетка. В случае же четырехкамерной камеры Горяева мы получаем предметное стекло с пятью прорезями, образующих четыре площадки, при этом две внутренние дополнительно разделены продольной прорезью для получения четырех камер с нанесенной микроскопической сеткой на поверхности площадок.
Рассмотрим более подробно особенности сетки. Специальная сетка наносится на внутренние площадки, расположенные ниже соседних боковых площадок на 0.1мм. Боковые площадки предназначены для притирания покровного стекла до появления Ньютоновских колец. Как правило, используют специальное покровное стекло для камеры Горяева с закругленными краями. После притирания покровного стекла создается камера, закрытая с двух боковых сторон, а с двух других остаются щели (так называемые, капиллярные пространства), через которые и заполняют камеру. Что конкретно представляет собой сетка? Микроскопическая сетка камеры Горяева расчерчена на большие и маленькие квадраты, сгруппированные различными способами. Сетка Горяева содержит 225 больших квадратов (15 рядов по 15 больших квадратов в каждом), разграфленных вертикально, горизонтально, крест-накрест и неразграфленных. При этом размеры малых делений клетки сетки составляют 0.05мм, а больших – 0.2мм. Важно, что малый квадрат со стороной 0.05мм во всех сетках является постоянной величиной. Не трудно рассчитать, что площадь малого квадрата равна 0.0025 мм2, а большого квадрата – 0.04мм2 . Тогда получаем, что объем жидкости над квадратом, образованным большими делениями сетки Горяева, составляет 0.004 микролитра.
Подсчитав количество форменных элементов (ФЭ) над большим квадратом, можно подсчитать плотность данного типа клеток в суспензии по формуле:
где X – количество ФЭ/мл, M- количество ФЭ над большим квадратом.
При работе с камерой Горяева важно следить, чтобы ее рабочие поверхности оставались сухими и чистыми. Кроме того, при подсчете форменных элементов нельзя допускать наличие воздушных пузырей на сетке камеры, так как они могут мешать точности подсчета.
После работы с камерами Горяева следует выполнить их дезинфекцию одним из допустимых способов:
- Погружение в 70%-ный раствор этилового спирта на 30 минут
- Погружение в 4%-ный раствор формалина на 60 минут при комнатной температуре.
Приведем примеры применения камеры Горяева и некоторые формулы.
Практическое применение камеры Горяева
Прежде чем приступить к проведению лабораторных исследований, рекомендуется тщательно протереть камеру Горяева небольшим кусочком чистого бинта, слегка смоченного в спирте. Мы не советуем использовать для этих целей вату, так как она может оставить волокна. Таким же образом следует обработать и покровное стекло для камеры Горяева. Учтите, что при использовании низкокачественного спирта на поверхностях может образоваться осадок, тем или иным образом мешающий проведению исследований. Чтобы избежать появления связанных с этим явлением нежелательных эффектов, рекомендуется дополнительно протереть камеру и покровное стекло чистым марлевым шариком без спирта. Притирание покровного стекла к камере должно быть выполнено очень тщательно до появления на месте контакта радужных колец (так называемых, цветных колец Ньютона) с обоих краев. Для лучшего притирания можно воспользоваться одной хитростью и слегка выдохнуть воздух на камеру и покровное стекло, так чтобы небольшое количество влаги сконденсировалось на поверхностях стекол, что обеспечит лучший контакт.
При отсутствии специальных покровных стекол, прилагающихся к камере Горяева, можно использовать обычные стандартные покровные стекла.
Помимо целевого использования камеры Горяева для подсчета форменных элементов крови и т.п., данное стекло может расцениваться как своеобразный эталон для определения увеличения микроскопа. Для этого следует воспользоваться следующей формулой:
X=(p1-p2)/(a*N)
где X – это увеличение микроскопа; p1 – положение левой границы клетки камеры Горяева; p2 – положение правой границы клетки или группы клеток; N – количество клеток между измеряемыми границами; a – размер клетки камеры Горяева (равен 0,05 мм).
Камера Горяева также используется для подсчёта количества клеток в культуре.
Для подсчета клеточных элементов в жидкостях, содержащих их в меньших концентрациях, используются аналогичные по конструкции камеры Фукса-Розенталя и Нажотта, имеющие большую глубину – 0.2 мм и 0.5 мм соответственно. Эти же камеры используются в альгологии для количественного учета фитопланктона. Часто камера Фукса-Розенталя используется для подсчета форменных элементов спинномозговой жидкости. В отличие от камеры Горяева, большие квадраты сетки Фукс-Розенталя не разграфлены и сгруппированы по 16 квадратов, причем каждая такая группа ограничена тройными линиями.
Подсчет форменных элементов крови
Наиболее часто камеры Горяева используются именно для определения форменных элементов крови при проведении лабораторных исследований. Так для подсчета эритроцитов кровь необходимо развести в 200 раз, лейкоцитов – в 20 раз. Количество форменных элементов (ФЭ) в 1мкл крови определяют по формуле:
где N – искомое количество ФЭ в 1 мкл крови; m – число ФЭ в определенном количестве малых квадратов; q – количество малых квадратов сетки камеры Горяева, в которых подсчитывались ФЭ, s – степень разведения крови.
Формула для подсчета эритроцитов
Для подсчета эритроцитов используются 5 больших или 80 малых квадратов сетки, расположенных по диагонали. Таким образом, получаем следующую формулу:
Формула для подсчета лейкоцитов
Для подсчета лейкоцитов можно использовать один из трех методов:
1. Лейкоциты считают в 64 больших (пустых) квадратах
2. Лейкоциты считают по всей сетке в 169 больших квадратах (рекомендуется для образцов крови с выраженной лейкопенией)
3. Лейкоциты считают в 100 больших квадратах (64 пустых + 36 разграфленных квадратов по периметру сетки)
Таблица нормальных значений:
| Форменные элементы | Норма | |
| Эритроциты | Мужчины | 4 000 000 – 5 100 000 в 1 мкл |
| Женщины | 3 700 000 – 4 700 000 в 1 мкл | |
| Лейкоциты | 4 000 – 9 000 в 1 мкл | |
Подсчет форменных элементов в мочевом осадке
Для определения ФЭ в мочевом осадке при анализах мочи по Нечипоренко, Аддис-Каковскому, Амбурже осуществляется по всей сетке Горяева и рассчитывается по формуле:
где N – число ФЭ в 1 мкл осадка; m – число ФЭ, подсчитанных по всей сетке; 0.676 – объем камеры Горяева (мкл)
Загрузка...